多摩川精機株式会社

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免疫沈降に関する質問

  1. 抗体を固定化させる際に最適なビーズはどれですか?

    非特異的吸着を抑えたい場合には表面のCOOH基を活性化させたNHS beadsを使用し、抗体を直接ビーズに固定化します。また、NHS beadsは解析時に抗体の遊離が少ないという利点があります。ただし、抗体のリジン残基とビーズ表面のNHS基で共有結合させるため、配向がランダムになります。抗体の配向をそろえたい場合や抗原の回収量を増やしたい場合には、Protein A beads、Protein G beadsをご使用ください。また、ビオチン化した抗体をお持ちの場合はStreptavidin beads、NeutrAvidinTM beadsへの固定化が可能です。

  2. 抗体の固定化量を定量する方法はありますか?

    固定化量の定量は固定化後のビーズの直接定量にて行えます。方法はプロトコール107をご参照ください。

  3. 抗体の固定化効率はどのくらいになりますか?

    使用するビーズの種類により異なりますので、各種製品情報をご参照下さい。

  4. 抗体の固定化効率(固定化量)を上げる方法はありますか?

    いくつかの方法があります。下記参照ください。
    ①NHS beadsの場合は固定化反応時間を長くすることで固定化量が増える場合があります。ただし、NHS基は加水分解を受けやすく、非特異的吸着の要因となるため、6時間以内として下さい。
    ②NHS beadsの場合は推奨固定化バッファ以外の組成によって固定化反応が阻害される場合があります。抗体保存溶液に塩などの添加物が含まれる場合はバッファ置換を行うことで固定化効率が上がります。
    ③固定化反応時の抗体添加量を上げることで固定化量が増加します。

  5. 抗体固定化ビーズの分散には超音波を使用しても良いですか?

    ビーズの分散はガリガリ法を推奨しております。超音波による分散を実施される場合は、氷冷下、断続的に超音波を当ててください。ガリガリ法については動画をご参照ください。

  6. 固定化反応の際、チューブ壁面へビ-ズが付着してしまうことがありますが、抑える方法はありますか?

    以下の方法で改善する場合があります:
    ・タンパク質低吸着チューブを用いる。
    ・攪拌を転倒混和でなくマイクロチューブミキサーによる攪拌にする。
    ・固定化反応後に、ガリガリ法(プラスチック製の試験管立てにマイクロチューブの底をあててガリガリと動かして分散させる方法)でビーズを分散させ、遠心(磁気)分離を行う。

  7. 抗体固定化後のビーズの分散性を向上させたいのですがどうすれば良いですか?

    抗体やタンパク質を固定化すると、ビーズが沈殿しやすくなることがあります。使用前にビーズを良く分散させて使用頂ければ問題ありませんが、更に分散性を向上したい場合、保存バッファ中から塩を除くことで分散性が向上します。